Vitrificación de ovocitos en pacientes oncológicas: experiencia en clínica ivi chile y revisión de la literatura / Vitrification of oocytes in oncological patients: experience in clinica ivi chile and review of literature

La sobrevida de pacientes con cáncer ha mejorado con el tiempo, especialmente en pacientes en edad fértil. La criopreservación de los ovocitos a través de la estimulación ovárica controlada (EOC) es la técnica más frecuente de preservación de la fertilidad. El objetivo del presente estudio es realizar un análisis descriptivo de los ciclos de pacientes que, previo al tratamiento de cáncer, realizaron un tratamiento de preservación de fertilidad. Se analizaron datos demográficos como edad, diagnóstico de ingreso y resultados clínicos, tales como tipo de protocolo de estimulación utilizado, número de ovocitos obtenidos, duración de la estimulación y momento de inicio en el ciclo. Resultados: La edad promedio fue 28.9 años. La duración media de la estimulación fue de 12 días, con un promedio de ovocitos obtenidos en total de 12. Se utilizaron 2 protocolos de estimulación ovárica, obteniendo mejores resultados con el esquema de antagonistas de GnRH asociado a letrozole y doble gatillante. Respecto al momento del ciclo en que se inició la estimulación ovárica, no hubo diferencias. Conclusiones: Es posible realizar preservación de la fertilidad previo a un tratamiento oncológico con buenos resultados en pacientes jóvenes, por lo que sugerimos realizarlo en todos los pacientes con diagnóstico oncológico antes el tratamiento del cáncer. Es recomendable comenzar la estimulación ovárica en cualquier fase del ciclo ya que se obtienen los mismos resultados y permite un pronto inicio de la terapia oncológica.

Survival of patients with cancer has been improving over time, especially in young patient with fertility intention. Cryopreservation of oocytes through controlled ovarian stimulation (EOC) is the most frequent technique of fertility preservation. We analyzed the data obtained from oncological patients who attended IVI Chile between January 2008 and May 2017 in search of fertility preservation. Demographic data were obtained: age, diagnosis of admission, type of stimulation protocol used, number of oocytes obtained, duration of stimulation and pregnancy rate. Results: The average age: 28,9 years; average duration of stimulation:12 days. Number of oocytes obtained in total: 12. Two ovarian stimulation protocols were used. The one with the best results was the protocol with GnRH antagonists associated with letrozole and double triggering. Regarding the moment of the cycle where to start ovarian stimulation, there were no differences. Conclusions: It is possible to carry out a fertility preservation treatment prior to an oncological treatment with good results in young patients, so we suggest the preservation of fertility in all patients with an oncological diagnosis before oncological treatment. It is recommended to start ovarian stimulation at any phase of the cycle since the same results are obtained.

Critical vitrification steps towards survival of Garcinia hombroniana (Clusiaceae) shoot tips after cryopreservation / Etapas críticas de vitrificación para la supervivencia de ápices caulinares de Garcinia hombroniana (Clusiaceae) después de crioconservación

Abstract A cryopreservation protocol was developed for in vitro shoot tips of Garcinia hombroniana using the vitrification technique. Four critical steps in the technique were investigated, namely preculture, loading, dehydration with Plant Vitrification Solution 2 (PVS2), and unloading. Shoot tips precultured for 48 h gave significantly higher survival (75 %) compared to 24 h preculture (50 %) after cryopreservation. Treatment with 1 M glycerol plus 0.4 M sucrose as a loading solution gave higher survival (45.83 %) compared to the other treatments (0.4 M sucrose + 2 M glycerol; 0.4 M sucrose). Shoot tips dehydrated with PVS2 for 25 min gave the highest survival after immersion in liquid nitrogen. Stepwise PVS2 treatment for 15 min with 50 % PVS2 followed by 10 min with 100 % PVS2 solution improved survival of the shoot tips after cryopreservation (41.67 %). Murashige and Skoog medium with 0.4 M sucrose gave significantly higher survival (66.67 %) than MS with 1.2 M sucrose (25 %) as an unloading solution. Water content was shown to decrease throughout the whole vitrification steps from 6.83 ± 1.66 g g-1 dw for fresh shoot tips down to 2.93 ± 0.28 g g-1 dw after PVS2 treatment. Further study on each step including recovery medium is required to improve the survival. Nevertheless, the present study showed the potential of using the vitrification technique for cryopreservation of G. hombroniana. Rev. Biol. Trop. 66(3): 1314-1323. Epub 2018 September 01.

Resumen Se desarrolló un protocolo de crioconservación in vitro para ápices caulinares de Garcinia hombroniana mediante la técnica de vitrificación, con cuatro etapas críticas: precultivo, carga de crioprotector, deshidratación con solución de vitrificación vegetal 2 (PVS2), y descarga. Ápices precultivados por 48 h sobrevivieron más (75 %) que los de 24 h (50 %) después de la crioconservación. El tratamiento con glicerol 1 M más sacarosa 0.4 M como solución de carga permitió mayor sobrevivencia (45.83 %) que los otros tratamientos (sacarosa 0.4 M + glicerol 2 M; sacarosa 0.4 M). Los ápices deshidratados con PVS2 por 25 min registraron la mayor sobrevivencia tras inmersión en nitrógeno líquido. El tratamiento gradual por 15 min con solución de PVS2 al 50 %, seguido por 10 min al 100 %, mejoró la sobrevivencia de ápices tras la crioconservación (41.67 %). El medio Murashige-Skoog (MS) con sacarosa 0.4 M produjo una sobrevivencia significativamente mayor (66.67 %) que MS con sacarosa 1.2 M (25 %) como solución de descarga. El contenido de agua disminuyó a lo largo del proceso de vitrificación desde 6.83 ± 1.66 g g-1 peso seco, en ápices frescos, hasta 2.93 ± 0.28 g g-1 peso seco después del tratamiento con PVS2. Se requiere de más investigación sobre cada etapa, incluyendo el medio de recuperación, para mejorar la tasa de sobrevivencia. Sin embargo, este estudio muestra el potencial de la vitrificación para la crioconservación de G. hombroniana.

Freeze-all en reproducción asistida

Los avances en los protocolos de vitrificación y los resultados obtenidos tras la transferencia de embriones congelados han dado lugar a una versión distinta de los ciclos estándar de reproducción asistida: los ciclos freeze-all. Independientemente de su uso frente a las indicaciones más comunes (progesterona elevada, riesgo de hiperestimulación, entre otros), este nuevo concepto hoy representa una práctica habitual en muchas clínicas siendo aplicado a todas las pacientes. En este artículo analizaremos los distintos factores que pudieron haber contribuido a este cambio de política y la evidencia científica en relación al tema. Basados en esta evidencia concluiremos si las clínicas deberían cambiar su forma de trabajo pasando de transferencias de embriones frescos a solo transferencia de embriones congelados o si deberíamos mantener el protocolo estándar.

Breakthroughs in vitrification protocols and the results obtained after frozen embryo transfer have resulted in a different version of the assisted reproduction standard cycles: the "freeze-all" cycles. Regardless of their use beyond the usual indications (elevated progesterone, risk of hyperstimulation, among others), this new concept currently represents a common practice in many institutions and is applied to all patients. In this article, we will discuss the various factors that may have contributed to this change in policy and the scientific evidence for this topic. Based on this evidence, we will conclude if clinics should change their way of working from fresh embryo transfers to only transfer frozen embryos, or if we should maintain the standard protocol.

Vitrificación de ovocitos y pacientes con cáncer

El incremento del uso de la criopreservación de ovocitos empieza después de la introducción de la técnica de vitrificación y el nacimiento del primer bebe logrado con este método en 1999. Usando esta poderosa herramienta, los científicos han ayudado a las mujeres a criopreservar sus gametos ya sea a través de la vitrificación de ovocitos o de corteza ovárica. Durante una década, fuertes avances en la tecnología de la vitrificación han mejorado la eficiencia clínica y sus resultados. Con estos avances se ha reducido la dependencia de la habilidad del operador y se ha elevado la tasa de éxito a niveles altos y homogéneos. Como resultado, la vitrificación se ha vuelto confiable y la tendencia actual está mostrando un incremento definitivo en su uso en comparación de la congelación lenta. El nuevo y avanzado método conocido como 'Método Cryotech' asegura que se logre 100% de viabilidad en ovocitos y embriones en cualquier estadio. La técnica se establece para asegurar y definir cambios en la técnica de criopreservación en el mundo entero. Debido al gran efecto emocional que causa el diagnóstico de cáncer y la necesidad de su inmediato tratamiento, los potenciales efectos gonadotóxicos del cáncer o de este tratamiento no son normalmente discutidos a la hora del diagnóstico. La preservación de la fertilidad es un reciente esfuerzo y muchos pacientes con cáncer y trabajadores de salud no están familiarizados con el desarrollo rápido que ha tenido tanto en la parte de investigación como en la implementación en la práctica clínica. Se han establecido algunas técnicas de preservación de fertilidad como la vitrificación de ovocitos y otros como vitrificación de corteza ovárica que ha sido validada en los últimos 5 años con niños saludables nacidos sin tratamiento de fertilidad, incluso cuando aún siguen considerándose casos experimentales. Combinando todos los conocimientos que ahora tenemos sobre vitrificación de ovocitos y corteza ovárica con la estimulación hormonal del ovario incluso en la fase lútea y la efectividad del proceso de la reproducción asistida, podemos afirmar que es posible preservar vidas reproductivas de pacientes con cáncer incluso en pacientes pediátricos.

The increase in the use of oocyte cryopreservation occurred after the introduction of the vitrification technique and the birth of the first baby with this method in 1999. Using this powerful tool, scientists have helped women to cryopreserve their gametes by oocyte or ovarian cortex vitrification. For a decade, important advances in vitrification technology have improved clinical efficiency and results. This progress has reduced the dependence on the operator skill and has increased the success rate to high and homogeneous levels. As a result, vitrification has become reliable and the current trend shows a definite increase in its use compared to slow freezing. The new and advanced method known as â€oeCryotech method” ensures achievement of 100% viability in oocytes and embryos at any stage. The technique is set to make definite changes in the procedure of cryopreservation in the whole world. Due to the great emotional effect caused by cancer diagnosis and the need for immediate treatment, the potential gonadotoxic effects of cancer or its treatment are not normally discussed at the time of diagnosis. Fertility preservation is a recent effort, and many cancer patients and health workers are not familiar with its rapid development on research and on implementation in clinical practice. Some techniques of fertility preservation as oocyte or ovarian cortex vitrification have been validated in the past 5 years with healthy children born without fertility treatment, even when these continue to be experimental cases. Combining all the knowledge we now have on oocytes and ovarian cortex vitrification with hormonal stimulation of the ovary even in the luteal phase and the effectiveness of the process of assisted reproduction, we can say that it is possible to preserve reproductive lives of patients with cancer even in pediatric patients.

Assessment of mouse oocytes ultrastructure following vitrification before and after in vitro maturation / Evaluación de la ultraestructura de los ovocitos de ratón después de la vitrificación antes y después de la maduración in vitro

SUMMARY: Vitrification is a physical process in which the concentrated cryoprotectant solution after exposure to extreme cold without ice crystal formation in living cells to be converted glassing state. In this study, maturation rate and ultrastructure of mouse oocytes followed by vitrification before or after in-virto maturation (IVM) were evaluated. A total of 373 germinal vesicle oocytes were obtained from ovaries and divided into three fresh IVM, IVM vitrified, vitrified IVM groups. Ten metaphase II oocytes were obtained from uterine tubes and considered as the control group. Oocytes in vitrified groups were vitrified by Cryotop using vitrification medium and kept in liquid nitrogen. The maturation media was a-MEM supplemented with rFSH + hCG. After 24-48 h of incubation, the oocytes were investigated for nuclear maturation and ultrastructural changes using transmission electron microscopy (TEM). The oocyte maturation rate in vIVM group was significantly lower than IVMv group, when the two groups were compared with vIVM had the highest maturity. The evaluation ultrastructure of the four groups showed that the number of cortical granules, microvilli and mitochondria-SER aggregates in vIVM group were lowest and the highest amongst the number of vacuoles. Zona pellucida was darker than the control group in two freeze groups vIVM and IVMv. Most similar groups to the control group were group vIVM, Group IVMv and ultimately vIVM group, respectively. According to the results, IVM procedure is more efficient when it is performed before oocyte vitrification.

RESUMEN: La vitrificación es un proceso físico en el que la solución concentrada de crioprotectores, después de la exposición al frío extremo sin formación de cristales de hielo en las células vivas, se convierte en estado de cristal. En este estudio, se evaluaron la velocidad de maduración y la ultraestructura de los ovocitos de ratón seguidos por la vitrificación antes o después de la maduración in vitro (IVM). Se obtuvieron un total de 373 ovocitos, de vesículas germinales de ovarios, y se dividieron en tres grupos de IVM vitrificados, IVM e IVM frescos. Diez ovocitos metafase II se obtuvieron a partir de tubas uterinas y se consideraron como el grupo de control. Los ovocitos en grupos vitrificados fueron vitrificados por Cryotop usando medio de vitrificación y mantenidos en nitrógeno líquido. El medio de maduración fue a-MEM suplementado con rFSH + hCG. Después de 24-48 h de incubación, fueron observados en los ovocitos la maduración nuclear y cambios ultraestructurales utilizando microscopía electrónica de transmisión (MET). La tasa de maduración de los ovocitos en el grupo vIVM fue significativamente más baja que en el grupo IVM v, cuando los dos grupos se compararon con los que tenían la mayor madurez. La evaluación de la ultraestructura de los cuatro grupos mostró que el número de gránulos corticales, microvellosidades y acúmulos de mitocondrias-SER en el grupo vIVM fue el más bajo y el más alto entre el número de vacuolas. La zona pelúcida fue más oscura en dos grupos de congelación vIVM e IVMv, que en el grupo control. La mayoría de los grupos, similares al grupo de control, fueron los grupos vIVM, IVMv y,finalmente, el grupo vIVM, respectivamente. De acuerdo con los resultados, el procedimiento de IVM es más eficiente cuando se realiza antes de la vitrificación de ovocitos.

Recidiva de teratoma ovárico tras encefalitis anti-NMDA y manejo de la fertilidad: caso clínico / Ovarian teratoma recurrence after anti-NMDA encephalitis and fertility management: a clinical case

RESUMEN CASO CLÍNICO: la encefalitis anti receptor N-metil D-aspartato (NMDAR) es un trastorno autoinmune con un amplio espectro de síntomas neuropsiquiátricos. Se presenta el caso de una mujer de 22 años con una encefalitis anti-NMDA que cursó con amnesia, crisis parciales complejas y alteraciones del comportamiento asociado a un teratoma ovárico. La evolución fue adecuada con cirugía e inmunosupresores. A los tres años se objetivó un teratoma contralateral, sin recidiva de encefalitis; que fue extirpado tras estimulación ovárica para criopreservación de ovocitos. CONCLUSIONES: el teratoma ovárico debe ser sospechado ante la presencia de una encefalitis atípica. Antes de realizar cirugías ováricas repetidas, debe valorarse la opción de vitrificación ovocitaria si los deseos genésicos de la mujer no están cumplidos.

ABSTRACT CLINICAL CASE: anti-N-methyl-D-aspartate-receptor (NMDAR) encephalitis is an autoimmune disorder with a wide sprectrum of neuropsyquiatric symtoms. A case of a 22 years old woman with NMDAR encephalitis presenting with amnesia, focal complex seizures and behavior disturbances associated with an ovarian teratoma is reported. Three years after the first episode, a contralateral teratoma was observed, with no recurrence of the encephalitis; teratoma excision was performed, after controlled ovarian stimulation for oocyte cryopreservation. CONCLUSIONS: ovarian teratoma must be suspected when atypical encephalitis occurs. Before performing repetead ovarian surgeries, oocyte vitrificaction must be considered as a fertility-sparing option in women who have not completed their childbearing wishes.

Vitrificación de ovocitos bovinos parcialmente madurados de la raza frisón rojo chileno / Vitrification of partially matured bovine oocytes of the Chilean red friesian breed

Se evaluó la tasa de maduración in vitro post descongelación de ovocitos bovinos, de la raza Frisón Rojo Chileno, parcialmente madurados y vitrificados. Complejos Cúmulus-ovocito fueron obtenidos por aspiración folicular, clasificados morfológicamente y aleatoriamente cultivados in vitro en TCM199 (10 % Suero Fetal Bovino (SFB), 50 mg/mL gentamicina, 0,2 mM piruvato de sodio, 0,08 µg/mL FSH, 1 µg/mL LH y 1 µg/mL estradiol) en los grupos: a) control (n= 137), madurados por 24 h a 38,5 C, 5 % CO2 y 99 % humedad y, b) tratamiento (n= 156), madurados por 6 h, parcialmente denudados, e incubados hasta completar 20 h, para luego ser vitrificados por el método Open Pulled Straws (OPS). Los ovocitos fueron expuestos a la solución de vitrificación uno (SV1) (Buffer Fosfato Salino (PBS), 10 % Etilenglicol (EG), 10% DMSO) por 30 s, posteriormente traspasados a la SV2 (PBS, 20 % EG, 20 % DMSO) por 25 s. Inmediatamente los ovocitos fueron cargados en pajuelas francesas estiradas (OPS) y sumergidos en nitrógeno líquido. Las ovocitos fueron descongelados introduciéndolos en una secuencia de soluciones con concentraciones decrecientes de sucrosa (0,3; 0,15 y 0 M respectivamente). Finalmente, los ovocitos continuaron con la maduración por 4 h adicionales. Posterior al periodo de maduración, los ovocitos de ambos grupos fueron fijados, teñidos y evaluados. Las proporciones de ovocitos en Metafase I (MI), Metafase II (MII) y degenerados fueron comparadas mediante el test de Chi cuadrado. La vitrificación aumentó (p 0,05) el porcentaje de pérdida y de ovocitos dañados en comparación al control. Además, aumentó (p 0,05) la tasa de ovocitos en MI y el número de ovocitos degenerados, y redujo el porcentaje de ovocitos MII, en comparación al control. Por tanto, la vitrificación por el método Open Pulled Straw de ovocitos parcialmente madurados in vitro es una alternativa viable para la conservación de material genético de hembras Frisón Rojo Chileno.

Post thawing in vitro maturation rate was evaluated for partially matured vitrified oocytes from Chilean Red Friesian cattle. Cumulus-Oocytes Complexes were obtained by follicular aspiration, classified by morphology and randomly in vitro matured in TCM199 (10 % Bovine Fetal Serum (BFS), 50 mg/mL gentamicine, 0.2 mM sodium piruvate, 0.08 µg/ml FSH, 1 µg/mL LH and 1 µg/mL estradiol) in the following groups: a) control (n= 137), matured for 24 h at 38.5 C, 5 % CO2 y 99 % humidity, and b) treatment (n= 156), matured for 6 h, partially denuded, and incubated until completion of 20 h. Then, oocytes were vitrified by the Open Pulled Straws (OPS) method. Oocytes were exposed to vitrification solution one (VS1) (Phosphate Buffered Saline (PBS), 10 % Ethylen glycol (EG), 10 % DMSO) for 30 s, then they were exposed to VS2 (PBS, 20% EG, 20% DMSO) for 25 s. Afterwards, oocytes were loaded into open pulled straws and submerged into liquid nitrogen. Oocytes were thawed by exposure to sequential solutions with decreasing concentrations of sucrose (0.3; 0.15 y 0 M respectively). Finally, oocytes continued the in vitro maturation for 4 additional hours. After completion of maturation period oocytes from both groups were fixated, stained and evaluated. The proportion of lost and damaged, MI, MII, and degenerate oocytes were compared between groups by Chi square test. Vitrification procedure increased (p 0.05) the percentage of oocytes lost and damaged when compared to control group. Additionally, vitrification increased (p 0.05) the proportion of MI and degenerated oocytes, and decreased the proportion of MII oocytes. Therefore, vitrification by the OPS method of partially matured bovine oocytes is a reliable alternative for the conservation of germinal cells from Chilean Red Friesian females.

Viabilidad de Ovocitos Vitrificados y Madurados in Vitro de Gata Doméstica Adulta (Felis catus) en Estación Reproductiva / Vitrified and in Vitro Matured Oocytes Viability from Adult Housecat (Felis catus) in Reproductive Season

La vitrificación de ovocitos de mamíferos es considerada una técnica en experimentación. La supervivencia de los ovocitos es extremadamente variable, según las técnicas utilizadas e influida por una serie de condiciones. El objetivo de éste trabajo fue determinar los efectos de la vitrificación en ovocitos de gata domestica adulta en estación reproductiva y madurados in vitro. Se obtuvieron 33 ovarios correspondientes a hembras de más de un año en buen estado nutricional y sin tratamiento hormonal, ovariectomizadas en domicilio del propietario por profesional veterinario. Los ovarios fueron trasladados al laboratorio y se fragmentaron por microdisección bajo microscopio estereoscópico en caja de Petri con solución de buffer fosfato salino modificado con suero de ternero inactivado y antibióticos para la obtención, evaluación y selección de los complejos cúmulo-ovocitos (CCOs) de buena calidad. Se vitrificaron 506 CCOs en pajuelas de 0.25 ml con 10-12 ovocitos cada una y almacenados por 30 días en nitrógeno líquido (N2) a -196 C. Posteriormente se desvitrificaron las pajuelas, recuperándose 320 CCOs, los que fueron madurados in vitro. Transcurrido ese tiempo se evaluaron los CCOs, descartándose 50 por presentar signos de degeneración. En los 270 restantes se observó buena expansión del cúmulo, citoplasma uniforme y oscuro e integridad de la zona pelúcida. A estos últimos se los dividió en dos grupos similares para evaluar la viabilidad, a uno se lo coloreó con metil tiazol tetrazolio y al otro con Azul Tripán. En ambos se constató un resultado positivo para la viabilidad de los CCOs. El análisis de los resultados nos permite concluir que la vitrificación comprometió la integridad de un importante número de CCOs aunque más del 50% respondió en cultivo favorablemente, mostrando signos de viabilidad esperados. Estos resultados hacen necesarios la profundización en el mejoramiento del protocolo para incrementar el porcentaje de viabilidad.

Vitrification of mammalian oocytes is a technique considered in experimentation. Oocyte survival is extremely variable, according to the techniques used and influenced by a number of conditions. The objective of this study was to determine the effects of adult domestic cat oocyte matured in vitro and vitrified in breeding season. We obtained 33 ovaries from housecats in good nutritional status without hormonal treatment, ovariectomized by a veterinary professional at home. The ovaries were transported to the laboratory and fragmented by microdissection under a stereoscopic microscope in a petri dish with modified buffer saline phosphate solution, inactivated calf serum and antibiotics to the collection, evaluation and selection of good quality cumulus-oocyte complexes (COCs). 506 COCs were vitrified in 0.25 ml straws each with 10­12 oocytes and stored for 30 days in liquid nitrogen (N2) at -196 °C. Then the straws were thawed, recovering 320 CCOs, which were matured in vitro. After this time the COCs were evaluated, discarding 50 which showed signs of degeneration. In the remaining 270 COCs good cumulus expansion was observed and also uniformly dark cytoplasm and integrity of the zona pellucida. The latter were divided into two similar groups to assess the feasibility; one was stained with Methylthiazblyl tetrazolium and the other with Trypan Blue. Both tested positive for the viability of the CCOs was found. The analysis of the results allow us to conclude that vitrification compromised the integrity of a large number of CCOs although more than 50% responded favorably in culture, showing signs of expected viability. According to these results it is necessary to further improve the protocol to increase the percentage of viability.

Efecto de la vitrificación de ovocitos humanos sobre la capacidad de unión y el estado acrosomal de espermatozoides humanos / Effect of the vitrification of human oocytes on the binding capacity and acrosome status of human sperm

Conocer los aspectos moleculares que acontecen en el proceso de unión de los espermatozoides humanos a la zona pelúcida (ZP) humana es uno de los grandes retos de la biología de la Reproducción. Por otra parte conocer si el proceso de fecundación puede verse afectado por la criopreservación de los gametos femeninos sigue siendo otra cuestión debatida en la literatura. En base a esto, el objetivo principal de este trabajo fue conocer si la vitrificación ovocitaria puede alterar la interacción de los espermatozoides con el glicocáliz de la ZP y demostrar si la ZP de estos ovocitos pierde la capacidad de inducir la reacción acrosómica en los espermatozoides. Según nuestros resultados el método de vitrificación ovocitaria cerrado (S3) no altera la capacidad de unión de los espermatozoides a la zona pelúcida, ni la capacidad de ésta para inducir la reacción acrosómica.

To know the molecular aspects that occur in the process of human sperm binding to the human zona pellucida (ZP) is one of the great challenges of reproduction biology. Moreover knowing if the fertilization process may be affected by cryopreservation of female gametes is still another issue discussed in the literature. Based on this, the main objective of this study was to determine whether the oocyte vitrification may alter the interaction of sperm with the glycocalyx of ZP and show whether these oocytes lost the ability to induce the acrosome reaction in sperm. According to our results the oocyte closed vitrification method (S3) does not alter the ability of the sperm binding to the zona pellucida, and their ability to induce the acrosome reaction.

Criopreservación de embriones equinos y primer reporte de un potro de raza criolla colombiana nacido por transferencia de un embrión equino vitrificado / Cryopreservation of Equine Embryos and First Report of a Native Colombian Breed Born by Transfer of an Equine Vitrified Embryo / Criopreservação de embriões equinos e primeiro relatório de um potro de raça crioula colombiana, nascido por transferência de um embrião equino vitrificado

El objetivo de este artículo es informar sobre el éxito de un procedimiento de criopreservación de embriones equinos, a fin de conseguir una preñez viable. Se colectaron embriones equinos al día 6-6,5 (< 300 µm; n = 24) y se sometieron a dos técnicas de criopreservación: grupo 1 (n = 12), vitrificados exponiéndolos a una solución VS1 (Gli [1,4 M]) 5 min, VS2 (Gli [1,4 M] + EG [3,6 M]) y VS3 (Gli [3,4 M] + EG [4,6 M] 1 min. Se empacaron en pajillas de 0,25 ml y se sumergieron en nitrógeno líquido; grupo 2 (n = 12), congelación lenta: expuestos a una solución de congelación (1,8 M de EG + 0,1 M sucrosa) por 10 min, empacados en pajillas de 0,25 ml, llevados al congelador de embriones, exponiéndolos a una curva de congelación y sumergidos en nitrógeno líquido. Posterior a la descongelación, a los 24 embriones se les removió el crioprotector mediante un paso; fueron sumergidos en medio de cultivo DMEM/F12 + 10% de suero fetal bovino (SFB) e incubados bajo atmosfera controlada (5% CO2, 5% N2 90% O2) por 48 h. Se evaluó el desarrollo embrionario en el 75% de los embriones vitrificados (n = 4); el 20% de los embriones fueron sometidos a congelación lenta (n = 1). No se observaron diferencias significativas en los grupos respecto al desarrollo embrionario, pero sí mayor tendencia de supervivencia en los embriones vitrificados. Igualmente, uno de estos embriones vitrificados fue transferido a una receptora, se logró una preñez viable y el nacimiento de un potro vivo.

The aim of this paper is to report on the success of a cryopreservation procedure of equine embryos to achieve a viable pregnancy. Equine embryos were collected on day 6-6.5 (<300 µm, n = 24) and subjected to two cryopreservation techniques: group 1 (n = 12), vitrified, exposing them to a VS1 (Gli [1.4 M]) 5 min, VS2 (Gli [1.4 M] + EG [3.6 M]) and VS3 (Gli [3.4 M] + EG [4.6 M] 1 min solution. They were packed in 0.25 ml straws and immersed in liquid nitrogen; group 2 (n = 12), slow freezing: exposed to a freezing solution (1.8 M EG + 0.1 M sucrose) for 10 minutes, packed into 0.25 ml straws, brought to the embryos freezer, exposed to a freezing curve and immersed in liquid nitrogen. Following defrosting, cryoprotectants were removed from the 24 embryos in one step; they were submerged in culture medium DMEM/F12 + 10% of fetal bovine serum (FBS) and incubated under controlled atmosphere (5% CO2, 5% N2 90% O2) for 48 h. Embryonic development was evaluated in 75% of the vitrified embryos (n = 4); 20% of the embryos were subjected to slow freezing (n = 1). No significant difference was observed in the groups regarding embryonic development, but a greater survival tendency on the vitrified embryos was noted. Also, one of these vitrified embryos was transferred to a receiver, achieving a viable pregnancy and the birth of a living foal.

O objetivo deste artigo é informar sobre o sucesso de um procedimento de criopreservação de embriões equinos, a finalidade de conseguir uma prenhez viável. Coletaram-se embriões equinos ao dia 6-6,5 (< 300 µm; n = 24) e se submeteram a duas técnicas de criopreservação: grupo 1 (n = 12), vitrificados expondo-os à uma solução VS1 (Gli [1,4 M]) 5 min, VS2 (Gli [1,4 M] + EG [3,6 M]) e VS3 (Gli [3,4 M] + EG [4,6 M] 1 min. Se empacaram em tubos de 0,25 ml e se submergiram em nitrogênio líquido; grupo 2 (n = 12), congelação lenta: expostos a uma solução de congelação (1,8 M de EG + 0,1 M sacarosa) por 10 min, embalados em tubos de 0,25 ml, levados ao congelador de embriões, expondo-os a uma curva de congelação e submergidos em nitrogênio líquido. Posterior à descongelação, aos 24 embriões foi-lhes foi removido o crio protetor mediante um passo; foram submergidos em meio de cultivo DMEM/F12 + 10% de soro fetal bovino (SFB) e incubados bajo atmosfera controlada (5% CO2, 5% N2, 90% O2) por 48 h. Se avaliou o desenvolvimento embrionário no 75% dos embriões vitrificados (n = 4); o 20% de os embriões foram submetidos a congelação lenta (n = 1). Não se observaram diferenças significativas nos grupos com respeito ao desenvolvimento embrionário, mas sim uma maior tendência de sobrevivência nos embriões vitrificados. Igualmente, um destes embriões vitrificados foi transferido a uma receptora, obteve-se uma prenhez viável e o nascimento de um potro vivo.

Embarazo mediante tratamiento de maduración in vitro de ovocitos en paciente amenorreica y con historia de anorexia nervosa

La maduración in vitro (MIV) de ovocitos, generalmente utilizada en pacientes con ovario poliquístico y con síndrome de ovario poliquístico, ha sido aplicada para el tratamiento de infertilidad de una mujer con amenorrea secundaria y con historia de anorexia nervosa. Tras reiterados intentos infructuosos de estimulación ovárica por técnicas convencionales de reproducción asistida, se inició el tratamiento de MIV de ovocitos estimulándose los ovarios con FSHr durante el segundo, tercero y cuarto días del ciclo, aspirando los folículos antrales en el octavo día. Se obtuvo cuatro complejos cúmulo-ovocito, los que fueron cultivados en medio de maduración por 36 horas en presencia de FSH y hCG. Los ovocitos maduros en metafase II fueron fecundados mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y los embriones obtenidos fueron congelados por vitrificación al segundo día. Un mes después, se preparó el endometrio con valerato de estradiol. Los embriones descongelados fueron cultivados por 24 horas adicionales y se transfirió tres embriones. La paciente logró gestación única evolutiva con embrión activo.

Oocytes in vitro maturation (IVM) usually used in patients with polycystic ovaries and polycystic ovary syndrome has been applied for the treatment of infertility in a woman with secondary amenorrhea and history of anorexia nervosa. After repeated unsuccessful attempts of ovarian stimulation for conventional techniques of assisted reproduction, IVM treatment was begun by stimulating the ovaries with rFSH during the second, third and fourth day of the cycle and aspiring antral follicles on the eighth day. There were four cumulus-oocyte complexes that were cultivated in the maturation media for 36 hours in presence of FSH and hCG. Mature metaphase II oocytes were fertilized by intracytoplamatic sperm injection (ICSI) and embryos were frozen by vitrification on the second day. A month later, the endometrium was prepared with estradiol valerate. Thawed embryos were cultivated for 24 additional hours and three embryos were transferred. The patient achieved an evolutionary single gestation with active embryo.

Vitrificación ovocitaria para posponer fecundidad: experiencia de la Unidad de Medicina Reproductiva de Clínica Monteblanco / Oocyte vitrification to postponement of fertility

Antecedentes: Múltiples variables médicas y sociales han llevado al desarrollo de técnicas que permitan a la mujer posponer su fertilidad; dentro de ellas la vitrificación ovocitaria surge como una técnica relativamente sencilla y muy promisoria en este campo. Objetivo: Presentar la experiencia del Centro de Medicina Reproductiva de Clínica Monteblanco, en mujeres que han vitrificado sus ovocitos y posteriormente han intentado embarazarse con ellos. Método: Se revisaron todos los casos de vitrificación ovocitaria con posterior intento de embarazo, realizados desde el año 2007 a la fecha. Resultados: Del total de ciclos de vitrificación ovoci-taria, 22 mujeres han intentado un embarazo posterior al procedimiento. La mediana de edad al momento de la vitrificación fue de 36 años. En 10 pacientes no hubo transferencia embrionaria, ya fuera por no fecundación (4 casos) o por detención del desarrollo embrionario (6 casos); 12 pacientes fueron transferidas, la mitad de ellas lograron embarazo. Discusión: En este trabajo se presenta la primera serie nacional de casos de vitrificación de óvulos con posterior intento de embarazo; 12 de 20 pacientes lograron ser transferidas y 6 de ellas lograron el embarazo. Las mujeres más jóvenes vitrificaron un mayor número de ovocitos, tuvieron más embriones y tuvieron una mayor posibilidad de lograr embarazo. Conclusión: Pese a que la vitrificación ovocitaria no es una solución definitiva a la postergación de la fertilidad, representa en estos casos una alternativa válida.

Background: The postponement of pregnancy responds to several medical and social reassons. Oocy-te vitrification is a relatively simple and promising technique for this purpose. Objective: To illustrate the experience at the Reproductive Medicina Unit of Monteblanco of cases of women who underwent oocyte vitrification and attempted later to get pregnant. Methods: We reviewed all cases of oocyte vitrification with later attempt of pregnancy since 2007. Results: In the studied period, 20 cycles of oocyte vitrification were registered, thereof 22 women attempted a pregnancy after that. Median age at vitrification was 36 years old. Ten patient did not underwent embryo transfer, either by fertilization failure (4 patients) or detention of embryonic development (6 patients). Six of 12 patients that underwent embryo transfer, achieved pregnancy. Discussion: We report the first series of vitrification cases with posterior attempt of pregnancy in Chile; 12 of 20 women underwent embryo transfer and 6 of them got pregnant. Young women had a more oocytes, embryos and a better chance to achieve pregnancy. Conclusion: Despite the fact that vitrification is not the final solution for today's postponement of fertility, it represents a useful alternative for these cases.

Efecto de la Equilibración y la Tasa de Enfriamiento sobre la Viabilidad Post Vitrificación de Embriones Murinos / Effect of Equilibration and Cooling Rate on the Post Vitrification Viability of Murine Embryos

La técnica de criopreservación de embriones por vitrificación ha adquirido gran relevancia a nivel mundial debido a lo fácil de su ejecución, a los costos reducidos en equipos requeridos y, además por los altos niveles de viabilidad de embriones post vitrificación. Sin embargo, existe gran variabilidad entre los protocolos reportados, en especial en relación a las etapas de equilibración y enfriamiento. Con el objeto de contribuir al diseño de un protocolo estándar de vitrificación para la criopreservación de embriones murinos, se plantearon los siguientes experimentos: Experimento 1, se estudió el efecto de la tasa de enfriamiento (rápida y muy rápida) y el volumen de la solución (2µL y 1µL) sobre la viabilidad de embriones murinos post vitrificación, no observando efecto alguno del volumen de la solución (p>0,05), pero sí un efecto estadísticamente significativo (p<0,05) de la tasa de enfriamiento. Resaltando, que se obtuvo mejor resultado (81,3% de embriones viables), cuando se utilizó el protocolo de vitrificación Rápido-1 µL. Experimento 2, se evaluó la influencia del número de pasos y tiempo de equilibración sobre la viabilidad de embriones murinos, combinando protocolos de 4 pasos de exposición a los crioprotectores (1, 2, 3 y 4 pasos) y 4 tiempos de equilibración (5, 10, 15 y 20 min). La mayor tasa de viabilidad (p<0,05) fue obtenida empleando el protocolo 2 pasos-10min (93,8%). En conclusión, la presente investigación aporta detalles para la optimización del protocolo de vitrificación de embriones murinos.

The technique of cryopreservation of embryos by vitrification has acquired great relevance world-wide because of the easiness of the process, the low cost of the equipment, and the high levels of viability of the embryos after vitrification. Nevertheless, a great variability exists among the reported protocols, especially in relation to the steps of equilibration and cooling. In order to contribute to the design of a standard protocol of vitrification for murine embryos, the following experiments were conducted. Experiment 1 studied the effect of cooling rate (fast and very fast), and the volume of the solution (2µL and 1µL) on the viability of murine embryos post vitrification. No effect of the volume of the solution (p>0.05) was observed, but a significant (p<0.05) effect of the cooling rate was shown. Understanding that the best results (81.3% of viable embryos) were obtained when the Fast - 1µL protocol of vitrification was used. Experiment 2 evaluated the influence of the number of steps and the equilibration time on the viability of murine embryos, combining four step protocols of exposition to cryoprotectant (1, 2, 3 and 4 steps) and four times of equilibration (5, 10, 15 and 20 min). The highest rate of viability (p<0.05) was obtained with 2 steps-10min (93.8%). In conclusion, the present work gives details for the optimization of the vitrification protocol of murine embryos.

Primer informe en Uruguay de la vitrificación de embriones como alternativa real a la técnica de congelación lenta / First report in Uruguay on vitrification of embryos as a real alternative to slow freezing

Introducción: la vitrificación es una técnica de criopreservación de las denominadas "rápidas". En comparación con los tradicionales procesos de congelación lenta, la estrategia de vitrificación permite la eliminación total de la formación de cristales tanto intracelular como extracelularmente. Permite poner las células directamente en el crioprotector y sumergirlas en N2 líquido. Su aplicación en el mundo ha ido creciendo exponencialmente y se puede aplicar tanto a ovocitos como a embriones en cualquier estadio. Objetivos: revisión de la técnica de vitrificación y presentación de la experiencia de dos años en el Centro Iberoamericano de Reproducción Asistida, la primera en Uruguay. Material y método: se incluyeron 17 pacientes de las que se han vitrificado y desvitrificado embriones. Se usó el método comercial Cryotop con las soluciones de vitrificación de Kitazato. Resultados: con una media de embriones vitrificados de 2,71 (±0,69) por paciente, la tasa de supervivencia global de los embriones tras la desvitrificación fue de 93,4%. Con una media deembriones transferidos de 2,41 ±0,62), la tasa final de embarazo fue de 47,1%. La edad de las pacientes en las que se logra embarazo es menor (media 30,0 ±2,51) que las que no lo logran.Conclusiones: la vitrificación como método de criopreservación se muestra prometedor y como buen sustituto de las técnicas de congelación lentas, debido a su alta tasa de éxito, su fiabilidad y la rapidez de ejecución, con resultados reproducibles.

Introduction: vitrification is a cryopreservation technique that forms part of the so called "fast" cryopreservation techniques. Compared to traditional slow freezing processes, vitrification enables the total elimination of both intracellular and extracellular crystal formation. It allows for placing the cells directly on the cryoprotector and submersing them in liquid nitrogen. Its application around the world has exponentially grown and the technique may be applied both to ovocytes and embryos at all stages. Objectives: to carry out a review of the vitrification technique, the first one to be conducted in Uruguay, and to present the two-year experience at the Ibero-American Center for Assisted Reproduction. Method: we included 17 patients in our study, the embryos of which have been vitrified and unvitrified. We used the commercial Cryotop method with the Kitazato vitrification solutions. Results: with an average of 2,71 (±0,69) vitrified embryos per patients, global embryo survival rate after vitrification was 93,4%. With an average of 2,41 (±0,62) embryos transferred , the final pregnancy rate was 47,1%. The average age of patients who succeeded in getting pregnant is lower (average 30,0 ±2,51) than those who fail to get pregnant. Conclusions: vitrification as a cryopreservation method appears to be a promising technique and seems to be a good substitute for show freezing technique, due to its high-success rates, its reliability and execution speed, with replicable results.

Introdução: a vitrificação é uma técnica de criopreservação do grupo das chamadas técnicas "rápidas". Comparada com os processos tradicionais de congelação lenta, a vitrificação permite eliminar totalmente a formação de cristais tanto intra como extracelulares. Permite também colocar as células diretamente no crioprotetor e submergi-las em N2 líquido. Em todo o mundo sua aplicação vem crescendo exponencialmente e pode ser utilizada tanto com ovócitos como a embriões em qualquer estágio. Objetivos: revisão da técnica de vitrificação e apresentação da experiência de dois anos no Centro Iberoamericano de Reprodução Assistida, a primeira no Uruguay. Material e método: foram incluídas 17 pacientes que cujos embriões haviam sido vitrificados e desvitrificados. O método comercial Cryotop com soluções de vitrificação de Kitazato foi utilizado. Resultados: A média de embriões vitrificados foi de 2,71 (±0,69) por paciente com uma taxa de sobrevivência global dos embriões depois da desvitrificação de 93,4%. Com uma média de embriões transferidos de 2,41 (±0,62), a taxa final de gravidez foi de 47,1%. A idade das pacientes que engravidaram (média 30,0 ±2,51) era menor que a das que não engravidaram. Conclusões: a vitrificação se apresenta como um método de criopreservação prometedor e um bom substituto das técnicas de congelação lenta devido às altas taxas de sucesso, sua confiabilidade e rapidez para sua execução, com resultados reproduzíveis.

Survival of vitrifi ed mouse blastocysts loaded intoglass micro-capillaries / Sobrevivencia embrionaria de blastocistos murinos vitrificados en microcapilares de vidrio / Sobrevivência embrionária de blastocistos murinos vitrificados em micro capilares de vidro

The purpose of this study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouseblastocysts loaded into glass micro-capillaries (Brand® - 5 μL). Early morning on day 4 of pregnancy,blastocysts were collected from donors, morphologically evaluated, and then allocated in three groups:Group 1 (Control): embryos were transferred into 100 μL of KSOM medium drops and in vitro culturedduring 72 h; Groups 2 and 3: embryos initially exposed to the equilibration solution (PBSm + 10% EG+ 10% PROH and 0.5% PVA) for 1 min, and then to vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20%PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. After that, blastocysts were loaded into glass micropipettes (GMP) or glassmicrocapillaries (GMC) and plunged into super-cooled liquid nitrogen (-200 °C). Embryo warming andcryoprotectant dilution were carried out into 500 μL droplets of PBSm supplemented with 0.25 M sucrosemaintained at 37 °C. After 5 min embryos were transferred to 100 mL droplets of KSOM medium andcultured in vitro for 72 h. Blastocyst expansion rates after in vitro culture were 77% (138/177) and 74%(131/175), for blastocysts vitrified in GMP and GMC, respectively. Blastocyst hatching rate (control group)was 91% (134/146), which was higher than for embryos loaded in GMP 61% (108/177) and GMC 53%(93/175). ICM number in control group embryos contained 25.7 ± 2.5 cells and did not differ from themean cell number observed in vitrified embryos loaded in GMP (24.2±2.3) or GMC (22.5±2.59). Regardingthe trophoectoderm cell number, Group 1 embryos displayed 63.1±3.0 cells, and also not differ from the cellnumbers of the embryos loaded into GMP (58.0±1.8) or GMC (58.0±.3.7). In conclusion, manufacturedGMC (Brand®) tested in this study showed same efficiency as GMP for vitrification of mouse blastocysts.

El objetivo de este estudio fue determinar las tazas de expansión y eclosión in vitro de los blastocistosmurinos vitrificados en micro-capilares de vidrio (Brand® - 5 μL). En el día 4 de preñez, los blastocistoseran colectados de las donantes, evaluados morfológicamente y localizados en tres diferentes grupos:Grupo 1 (Control): compuesto por los embriones que eran transferidos a gotas de 100 μL de medio KSOMy cultivados in vitro por un periodo de 72 h; Grupos 2 y 3: compuesto por los embriones que eran expuestosinicialmente a la solución de equilibrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min,y posteriormente a la solución de vitrificación (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por unperiodo de 30 seg. Posteriormente, los blastocistos, eran almacenados dentro de micro-pipetas de vidrio(GMP) o micro-capilares de vidrio (GMC) y sumergidos en nitrógeno líquido (-200 °C). La dilución delos crioprotectores y desvitrificación de los embriones fue realizada al colocarlos en gotas de 500 μLde PBSm suplementado con 0.25 M de sacarosa a una temperatura de 37 °C. Después de 5 minutos losembriones fueron transferidos a gotas de 100 μL de medio KSOM y cultivados in vitro por 72 h. Las tazasde expansión de los blastocistos, posteriores al cultivo fueron de 77% (138/177) y 74% (131/175), para losblastocistos vitrificados en GMP y GMC, respectivamente. Las tazas de eclosión fueron de 91% (134/146)para el grupo control, siendo mayores que para los embriones vitrificados en GMP 61% (108/177) y GMC53% (93/175). El número del índice de masa celular interna (ICM) para los embriones del grupo controlfue de 25.7 ± 2.5 células, no teniendo diferencia significativa con el número de células observado en losembriones vitrificados en GMP (24.2±2.3) ó GMC (22.5±2.59).

O objectivo de este estudo foi determinar as taxas de expansão e eclosão in vitro dos blastocitos murinosvitrificados em micro capilares de vidro (Brand® - 5 μL). No quarto dia de prenhes, os blastocitos foramcolectados das doadoras, avaliados morfologicamente e localizados em três diferentes grupos: Grupo 1(Controle): composto por os embriões que foram transferidos a gotas de 100 μL de KSOM e cultivados invitro por um período de 72 h; Grupos 2 e 3: composto por os embriões que foram expostos inicialmente ásolução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH e 0.5% PVA) por 1 min, e posteriormente á soluçãode vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por um período de 30 seg. Posteriormente,os blastocistos, foram armazenados dentro de micro pipetas de vidro (GMP) ou micro capilares de vidro(GMC) e submergidos em nitrogénio líquido super-resfriado (-200°C). A diluição dos crioprotetores edesvitrificação dos embriões foi realizada ao colocar-lhos em gotas de 500 μL de PBSm suplementadocom 0.25 M de sacarose a uma temperatura de 37 °C. Depois de 5 minutos, os embriões foram transferidosa gotas de 100 μL de KSOM e cultivados in vitro por 72 h. As taxas de expansão dos blastocistos, posterioresao cultivo foram de 77% (138/177) e 74% (131/175), para os blastocistos vitrificados em GMP e GMC,respectivamente. As taxas de eclosão foram de 91% (134/146) para o grupo controle, e foram maioresos embriões vitrificados em GMP 61% (108/177) e GMC 53% (93/175). O número do índice de massacelular interna (ICM) para os embriões do grupo controle foi de 25.7 ± 2.5 células, não havendo diferenciasignificativa com o número de células observado em embriões vitrificados em GMP (24.2±2.3) ou GMC(22.5±2.59). Alem do mais, as células do trofoectodermo, no grupo controle apresentaram 63.1±3.0células, no sendo diferente às células dos embriões vitrificados em GMP (58.0±1.8) ou GMC (58.0±.3.7).

Efecto de la maduración in vitro de oocitos bovinos con suero fetal bovino sobre su actividad mitocondrial post-desvitrificación / The effect of in vitro maturation of bovine oocites with fetal bovine serum on their mitochondrial activity following devitrification

Objetivo. Evaluar el efecto de la maduración in vitro (MIV) con suero fetal bovino (SFB) sobre la actividad mitocondrial (potencial de membrana) de oocitos bovinos desvitrificados. Materiales y métodos. Se recolectaron oocitos bovinos a partir de ovarios post-mortem, para su posterior MIV en medio Sintetic Oviductal Fluid Amino Acids (SOFaa) en tratamientos con y sin SFB. Posteriormente, fueron destinados para su criopreservación mediante vitrificación en Open Pulled Straw (OPS). Los oocitos fueron desvitrificados y evaluados para su potencial de membrana mitocondrial mediante el uso del colorante fluorescente JC-1. Los datos fueron analizados mediante la prueba t de Student y un análisis de varianza. Resultados. Los resultados evidenciaron una diferencia estadística (p<0.05) entre los tratamientos de MIV para los niveles cuantificados de potencial de membrana mitocondrial de los oocitos desvitrificados, con promedios de 39.8 ± 2.38% y 50.3 ± 2.59% para MIV con y sin suero respectivamente. No se encontró un efecto del suero en la MIV, sobre la distribución de mitocondrias de alto potencial de membrana, sin embargo, se observó diferencia estadística (p<0.05) para este parámetro entre los oocitos frescos y desvitrificados. Conclusiones. La presencia de SFB en la MIV de oocitos bovinos, ejerció un efecto deletéreo sobre el potencial de membrana mitocondrial posterior a la criopreservación, y esta última modifica las proporciones de los patrones de distribución de mitocondrias de alto potencial de membrana de los oocitos bovinos madurados in vitro.

Estudio estructural del huso meiótico de ovocitos bovinos vitrificados / Structural study of meiotic spindle of vitrified bovine oocytes

La verificación de ovocitos bovinos se ha venido utilizando como uno de los protocolos de criopreservación más prometedores. Se ha expresado el temor por los efectos que puede causar la utilización de aditivos crioprotectores sobre la integridad estructural de los ovocitos. En este trabajo, los experimentos fueron conducidos para evaluar e efecto de vitrificación sobre la estructura del huso meiótio y la capacidad de desarrollo de ovocitos bovinos. Para ello, ovocitos acabados de loberar de sus folículos y madurados in vitro fueron expuestos a temperatura ambiente a las soluciones vitrificadoras (etilendlicol y sacarosa), también fueron vitrificados ovocitos inmaduros y madurados in vitro. Los ovocitos fueron teñidos in toto, para evaluar la maduración nuclear y a través de la tinción inmunocitoquímica fueron estudiadas las alteraciones estructurales del huso mieótico. Los ovocitos en estadio de VG, son más sensibles al efecto tóxico causado por los agentes crioprotectores a temperatura ambiente y al proceso de criopreservación, valorados mediante la progresión meiótica y el análisis inmunocitoquímico del huso meiótico. La anomalía más frecuentemente observada fue la ausencia del huso meiótico. La estructura del huso meiótico de ovocitos vitrificados MIV, es más resistentes al daño crioinducido, que los ovocitos vitrificados en estadio de VG. Se recomienda la vitrificación de ovocitos bovinos madurados in vitro.

Bovine oocytes vitrification has been used as one of the most promising cryopreservation protocols. Fear of the effects of cryoprotectant additives on the oocytes structural integrity have been posed. In this study, trials were conducted to evaluate the effects of vitrification over meiotic spindle structure and development capability in bovine oocytes. Based in this evidence, oocytes recently released from their follicles and in vitro matured were exposed at room temperature to vitrifying solutions (ethylenglicol and sucrose), also immature and in vitro matured oocytes were vitrified. Oocytes were stained in toto to assess nuclear maturation stage and meiotic spindle structural alterations were studied by immunocytochemistry. Oocytes at GV stage are more sensitive to the toxic effects caused by cryoprotectant agents at room temperature and to the cryopreservation procedure, assessed through meiotic progression and immunocytochemical analysis of meiotic spindle. The most frequently encountered anomaly was absence of meiotic spindle. Meiotic spindle structure in vitrified and IVM oocytes endure better the cryoinduced injuries compared with oocytes vitrified the GV stage. It is recommend the vitrification of in vitro matured bovine oocytes.